Badania przesiewowe w diagnostyce preimplantacyjnej

Sekwencjonowanie następnej generacji i mikromacierze – technologie oferowane przez Illumina umożliwiają uzyskanie szybkiej i wiarygodnej informacji w zakresie diagnostyki prenatalnej, w tym preimplantacyjnej diagnostyce przesiewowej (PGS)

preimplantacyjna
Opis ogólny

Badania przesiewowe w diagnostyce preimplantacyjnej (Preimplantation Genetic Screening PGS)

Mimo, że zapłodnienie in vitro (IVF) zrewolucjonizowało leczenie niepłodności, sam proces w dalszym ciągu pozostaje nieefektywny z niskim poziomem skuteczności [1]. Aneuploidie chromosomowe – aberracje liczbowe chromosomów, są jedną z głównych przyczyn niepowodzeń zabiegów in vitro. Większość zarodków z aberracjami chromosomowymi nie przejdzie procesu implantacji lub ulegnie poronieniu w pierwszym trymestrze ciąży [2,3]. Dlatego też, transfer wybranych zarodków z prawidłową liczbą chromosomów może znacząco poprawić skuteczność procedury IVF.

 

Główne zalety metody PGS to:

  • podwyższenie wskaźnika implantacji [4,5]
  • obniżenie odsetka spontanicznych poronień [4,6]
  • zwiększenie współczynnika uzyskanych ciąż [4,6,7]
  • możliwość transferu pojedynczych zarodków, co umożliwia ograniczenie liczby ciąż mnogich wysokiego ryzyka [4,6,7]

1.    Technologia FISH
2.    Technologia mikromacierzy
3.    Technologia sekwencjonowania następnej generacji (NGS)

Technologia FISH

Standardowa ocena zarodków w procesie IVF uwzględnia ich badanie morfologiczne i jest oceną subiektywną. Dlatego też, ze względu na fakt, że jedną z częstszych przyczyn spontanicznych poronień i braku powodzenia procedury IVF jest obecność aberracji chromosomowych, opracowano metody umożliwiające obiektywną ocenę liczby kopii poszczególnych chromosomów.

Pierwszą technologią wykorzystywaną w badaniach PGS była fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Metoda ta ze względu na wiele ograniczeń, w tym brak możliwości analizy wszystkich chromosomów oraz niską dokładność i czułość, przestała być wraz z rozwojem nowych technik wykorzystywana na szerszą skalę do wykrywania aneuploidii. Jej zasadniczą wadą była konieczność ograniczenia analizy do wybranych chromosomów, co wiązało się z ograniczonymi możliwościami detekcji barwników w mikroskopach fluorescencyjnych. Tym samym technika FISH wręcz uniemożliwiała badanie wszystkich chromosomów, co jest możliwe dzięki wykorzystaniu wielopunktowych metod analizy genomu, takich jak technologia mikromacierzy i sekwencjonowanie następnej generacji.

Firma Illumina jeszcze do niedawna miała w swojej ofercie sondy BlueFish Probes, które zostały stworzone z myślą o potwierdzeniu obecności aberracji chromosomowych wykrytych w badaniach z wykorzystaniem mikromacierzy. Zestaw sond opracowanych przez Illumina zawierał 26000 znakowanych sond, zlokalizowanych w całym genomie, które można wykorzystać nie tylko do potwierdzenia obecności niezrównoważenia chromosomowego, lecz także do analizy rodzicielskiego pochodzenia zmiany, a w niektórych przypadkach także do określenia fizycznej lokalizacji materiału genetycznego (np. w przypadku duplikacji z przeniesieniem materiału genetycznego).

Technologia mikromacierzy

W momencie wprowadzenia technologii mikromacierzy do diagnostyki preimplantacyjnej, znacząco wzrósł odsetek zarodków, które przeszły proces implantacji. Zastosowanie technologii mikromacierzy 24sure umożliwia badanie wszystkich chromosomów na wczesnym etapie rozwoju zarodka, co może pośrednio wpływać na wzrost skuteczności procedury zapłodnienia in vitro (IVF).

Technologia 24sure opracowana przez firmę BlueGnome jest techniką opartą o mikromacierze, która umożliwia badanie wszystkich chromosomów w czasie nieprzekraczającym 12 godzin. Zestaw 24sure Microarray Pack pozwala na szybką analizę genomu pod kątem niezrównoważenia materiału genetycznego, w tym zaburzeń liczby chromosomów lub obecności delecji / duplikacji obejmujących fragmenty chromosomów. Technologia 24sure została opracowana do analizy minimalnej ilości materiału genetycznego, co umożliwia badanie materiału pochodzącego z kilku komórek np. z biopsji trofoektodermy lub z pojedynczej komórki np. pojedynczego blastomeru zarodka lub ciałka kierunkowego. Jednocześnie metoda wykorzystująca mikromacierze 24sure jest metodą obiektywną, dającą wyniki o wysokiej wiarygodności, czego efektem wyższa skuteczność procesu zapłodnienia in vitro dzięki wskazaniu zarodków euploidalnych, które mają większą szansę na skuteczną implantację i dalszy rozwój. Badanie pod kątem aberracji chromosomowych z wykorzystaniem mikromacierzy może zostać zakończone w ciągu 12 godzin, co nie zaburza znacząco przebiegu, ograniczonego czasowo, cyklu IVF.

Technologia 24sure wykorzystuje technikę hybrydyzacji jednokolorowej – znakowany fluorescencyjne genomowy DNA przyłącza się do komplementarnych sekwencji sond DNA unieruchomionych na powierzchni szklanych mikromacierzy. Odpowiedni dobór sond umożliwia analizę całego genomu pod kątem zaburzeń ilości materiału genetycznego. Jednocześnie z próbką badaną analizowane są próbki kontrolne – męska i żeńska, dzięki czemu możliwa jest analiza porównawcza i ocena obecności ewentualnych aberracji chromosomowych.

Technologia 24sure wykorzystuje standardowe metody laboratoryjne, co powoduje że z łatwością można ją zaadaptować do procedur w już istniejących laboratoriach. Jednocześnie, stosowana procedura jest względnie prosta – do minimum ograniczono liczbę etapów wymagających przeniesienia próbki, co sprawia że prawdopodobieństwo popełnienia błędu jest niskie. Zaplanowano także specjalne punkty kontroli jakości oraz momenty, w których procedura może zostać bezpiecznie przerwana.

Analiza danych prowadzona jest automatycznie z wykorzystaniem innowacyjnego oprogramowania BlueFuse Multi, dzięki któremu analiza nie jest skomplikowana. Dodatkowo oprogramowanie umożliwia przechowywanie danych w sposób ustrukturyzowany, co ułatwia dostęp do wyników analiz dotyczących poszczególnych pacjentów.

Technologia 24sure to:

  • najczęściej stosowana i cytowana metoda w referencyjnych laboratoriach PGS na świecie
  • ponad 350.000 prób zbadanych z wykorzystaniem metody
  • szybkie i pewne wyniki – analiza wszystkich chromosomów w czasie nie dłuższym niż 12 godzin
  • łatwa procedura – zoptymalizowany protokół minimalizuje ilość czynności wymagających przeniesienia próbki, optymalnie dobrane punkty kontroli jakości przebiegu procedury na wielu etapach i momenty, w których procedura może zostać bezpiecznie przerwana

Technologia sekwencjonowania następnej generacji (NGS)

Technologia sekwencjonowania następnej generacji (NGS), to znaczący przełom w wysokoprzepustowej analizie genomu, który umożliwił wprowadzenie nowych standardów w przesiewowych badaniach preimplantacyjnych. Dzięki podwyższeniu rozdzielczości analizy, uzyskane wyniki są bardziej wiarygodne. Dodatkowe zalety metody NGS to: łatwiejsza procedura, możliwość analizy większej liczby próbek w krótszym czasie i personalizacja stosowanych testów. Sekwencjonowanie następnej generacji z wykorzystaniem, opracowanej przez firmę Illumina, technologii sekwencjonowania przez syntezę, jest jedną z wiodących technik stosowanych w analizach genomu ludzkiego. Szacuje się, że aż 90% wszystkich danych z reakcji sekwencjonowania zostało uzyskanych dzięki technologii Illumina.

Przykładem wykorzystania technologii sekwencjonowania następnej generacji oraz sekwenatora MiSeq w badaniach preimplnatacvyjnych jest zestaw VeriSeq PGS Kit. Umożliwia on dokładną analizę wszystkich chromosomów w kierunku obecności aneuploidii w czasie nie dłuższym niż 12 godzin, w pojedynczej reakcji. Podobnie jak macierze 24sure Microarray, zestaw VeriSeq PGS Kit jest zoptymalizowany do analizy DNA uzyskanego z kilku komórek pochodzących z biopsji trofoektodermy lub z pojedynczej komórki – blastomeru pobranego z 3 dniowego zarodka. Do przeprowadzenia analizy wystarczy 1ng DNA, który amplifikowany jest z wykorzystaniem zestawu SurePlex DNA Amplification System. Jakość uzyskanych wyników jest porównywalna do jakości danych otrzymywanych z wykorzystaniem mikromacierzy 24Sure Microarray, jednak stosowany protokół jest prostszy, zaś zastosowane podejście umożliwia analizę większej liczby próbek w krótszym czasie.

Zestaw VeriSeq PGS to kompletne rozwiązanie do badań PGS wykorzystujące technologię sekwencjonowania następnej generacji. W zestawie znajduje się:

  • Zestaw SurePlex DNA Amplification System do amplifikacji DNA z komórek pobranych z zarodka
  • zestaw VeriSeq Library Preparation Kit-PGS do przygotowania próbek do sekwencjonowania
  • zestaw VeriSeq Index Kit-PGS do multipleksowania próbek w pojedynczej reakcji sekwencjonowania (do 24 prób w 1 reakcji)
  • zestaw MiSeq Reagent Kit v3-PGS do sekwencjonowania przygotowanych próbek na sekwenatorze MiSeq
  • oprogramowanie BlueFuse Multi do analizy, archiwizacji oraz raportowania otrzymanych wyników
Specyfikacja techniczna

Technologia mikromacierzy

TechnologiaMikromacierz 24Sure
TechnikaMikromacierze
Maksymalna liczba próbek2 próbki/mikromacierz
Całkowity czas wykonania badania<12 godzin
System amplifikacjiSurePlex DNA Amplification System
Przygotowanie próbki do analizy24Sure Fluorescent Labelling System
Oprogramowanie do analizyBlueFuse Multi

 

Protokół obejmuje 5 następujących etapów:

1. Izolacja i amplifikacja materiału wyjściowego – izolacja DNA z pojedynczych komórek, zawieszonych w buforowanym roztworze soli fizjologicznej, świeżych lub mrożonych, i amplifikacja DNA za pomocą zestawu SurePlex DNA Amplification System. Po kontrolnej ocenie jakości, powielony materiał może zostać wykorzystany do dalszych analiz lub przechowywany w odpowiednich warunkach

2. Znakowanie – znakowanie powielonego materiału z wykorzystaniem metody random priming i barwników cyjaninowych (Cy) z zastosowaniem 24Sure Fluorescent Labelling System.

3. Hybrydyzacja – hybrydyzacja znakowanych fragmentów do mikromacierzy 24sure Microarray wraz z usunięciem niezwiązanego DNA

4. Skanowanie – skanowanie macierzy z wykorzystaniem skanera laserowego i utworzenie plików graficznych do dalszej analizy

5. Analiza danych – przechowywanie, analiza i interpretacja wyników z wykorzystaniem oprogramowania BlueFuse Multi. Analiza jest całkowicie automatyczna, a jej wyniki obiektywne i łatwe do interpretacji.

Zestaw 24Sure Pack

Zestaw 24sure Pack zawiera odczynniki niezbędne do przeprowadzenia analizy wszystkich chromosomów pod kątem aberracji chromosomowych w materiale pochodzącym z kilku lub pojedynczej komórki, pobranym z zarodków. Każda mikromacierz umożliwia przeprowadzenie 2 reakcji hybrydyzacji. Sondy DNA, znajdujące się na mikromacierzach 24Sure Microarray pochodzą z klonów BAC znajdujących się w kolekcji klonów dla genomu ludzkiego, zdeponowanej w Roswell Park. DNA z wybranych klonów BAC jest amplifikowany techniką PCR, a następnie unieruchamiany na powierzchni mikromacierzy. Każdy fragment jest nanoszony na mikromacierz w dwóch powtórzeniach. Klony wykorzystane do projektowania mikromacierzy zostały wyselekcjonowane tak, aby były zlokalizowane w odległości około 1Mb od siebie, dawały silny i specyficzny sygnał względem sortowanych cytometrycznie chromosomów i nie znajdowały się w miejscach polimorficznych lub regionach związanych z określoną chorobą. Po analizie danych z wykorzystaniem oprogramowania BlueFuse Multi, które usuwa niespecyficzne „szumy”, efektywna rozdzielczość mikromacierzy24sure została określona na 20Mb.

W mikromacierzach 24sure (v.3) wykorzystane zostało znakowanie próbek pojedynczym barwnikiem fluorescencyjnym. Możliwa jest zatem jednoczesna hybrydyzacja próbek znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie ich analiza in silico w odniesieniu do znakowanych próbek referencyjnych, hybrydyzowanych równolegle. Mikromacierze 24sure umożliwiają bardziej efektywne wykorzystanie macierzy, odczynników do reakcji znakowania oraz zajmują mniej czasu, niż metoda opierająca się na wykorzystaniu różnych barwników fluorescencyjnych do znakowania próbki badanej i kontrolnej i ich jednoczesnej hybrydyzacji do mikromacierzy.

Zastosowana technika hybrydyzacji jednokanałowej (single-channel) wymaga uwzględnienia w każdej analizie 4 znakowanych próbek referencyjnych, dwóch żeńskich i dwóch męskich. Oprogramowanie BlueFuse Multi porównuje intensywność fluorescencji dla próbki badanej w odniesieniu do próbek kontrolnych, analizowanych w tym samym czasie i tym samym badaniu.

Jedno opakowanie odczynników zawiera 8 mikromacierzy 24Sure Microarray
(2 hybrydyzacje/mikromacierz), zestaw odczynników do znakowania DNA – Fluorescent Labeling System na 32 reakcje oraz ludzkie DNA – COT Human DNA. Zatem zestaw umożliwia przeprowadzenie 16-tu reakcji hybrydyzacji.

Do analizy wyników zostało opracowane oprogramowanie BlueFuse Multi (v.3.0 lub późniejsze), którego użycie jest zalecane przez producenta mikromacierzy 24sure Microarray. Bazy danych, wykorzystywane w oprogramowaniu BlueFuse Multi, są regularnie uzupełniane o nowe typy mikromacierzy i informacje dotyczące anotacji danych. W analizie powinna być wykorzystywana najnowsza wersja bazy danych, tak aby wyniki badania były jak najbardziej wiarygodne.

Więcej informacji o zestawie 24Sure

 

Technologia sekwencjonowania następnej generacji (NGS)

TechnologiaVeriSeq PGS Kit – MiSeq System
Technikasekwencjonowanie następnej generacji
Maksymalna liczba próbek24 próbki / 1 reakcja sekwencjonowania
Całkowity czas wykonania badania<12 godzin
System amplifikacjiSurePlex DNA Amplification System
Przygotowanie próbki do analizyVeriSeq Library Preparation Kit-PGS, VeriSeq Index Kit-PGS
Oprogramowanie do analizyBlueFuse Multi

 

Zestaw VeriSeq PGS Kit – MiSeq System

Zestaw SurePlex DNA Amplification System, zawarty w zestawie VeriSeq PGS Kit umożliwia amplifikację genomowego DNA z komórek pochodzących z biopsji zarodka (blastocysta z zarodka 3 dniowego lub kilka komórek z biopsji trofoektodermy z zarodka 5-dniowrgo). Fragmentacja badanego DNA i przyłączenie sekwencji adaptorowych prowadzone jest z wykorzystaniem zestawu VeriSeq Library Preparation Kit-PGS działającego w oparciu o opracowaną przez firmę Illumina technologię transpozomów. Dalszym etapem procedury jest reakcja PCR o ograniczonej liczbie cykli, w której badany DNA jest nie tylko powielany, lecz również przyłączane są specjalne indeksy – fragmenty oligonukleotydowe umożliwiające identyfikację próbki po sekwencjonowaniu kilku bibliotek na aparacie MiSeq. Dzięki indeksowaniu możliwa jest analiza do 24 próbek w jednej reakcji sekwencjonowania. W zależności potrzeb użytkownika, analiza może zostać wykonana w trybie szybkim (jednoczesna analiza 12 próbek z pojedynczym indeksem) lub standardowym (24 próbki z podwójnymi indeksami).

Lista badanych próbek wraz z określeniem specyficznych dla nich indeksów przygotowywana jest w programie BlueFuse Workflow Manager i zapisywana w formacie umożliwiającym jej wykorzystanie w oprogramowaniu sekwenatora – MiSeq Control Software, lub w programie do analizy danych BlueFuse Software. Oprogramowanie MiSeq Control Software v.2.5 służy do wstępnej analizy danych (odczyt sekwencji, identyfikacja próbek, porównanie sekwencji do genomu referencyjnego). Pliki wynikowe *.bam importowane są do oprogramowania BlueFuse Analysis Software Multi, które automatycznie analizuje wyniki pod kątem obecności aneuploidii w poszczególnych próbkach. Ponadto oprogramowanie BlueFuse umożliwia łatwe wyszukanie informacji dotyczącej każdej próbki i cyklu IVF.

Zestaw VeriSeq PGS Kit-MiSeq zawiera odczynniki niezbędne do analizy 96 próbek, przy czym w jednej reakcji sekwencjonowania można analizować do 24 próbek. Zestaw zawiera SurePlex DNA Amplification System (100 reakcji), VeriSeq Library Preparation Kit-PGS (96 reakcji), VeriSeq Index Kit-PGS (24 indeksy dla 96 reakcji) i MiSeq Reagent Kit v3-PGS (sekwencjonowanie 4 x 24 próbki). Do systemu dołączone jest oprogramowanie BlueFuse Multi, które można pobrać ze strony internetowej Illumina. Szacuje się że rzeczywista rozdzielczość badania z wykorzystaniem zestawu VeriSeq PGS Kit wynosi 20Mb.

 

Więcej informacji o VeriSeq PGS Kit – MiSeq

 

Literatura:

1.SART CORS Clinic Summary Report (www.sartcorsonline.com/rptCSR_PublicMultYear.aspx?ClinicPKID=0) Accessed 16 December 2013.

2.Scott RT Jr, Ferry K, Su J, Tao X, Scott K, et al. (2012) Comprehensive chromosome screening is highly predictive of the reproductive potential of human embryos: a prospective, blinded, nonselection study. Fertil Steril 97(4): 870–875.

3.Tobias E, Connor JM, Ferguson-Smith (2011) Essential medical genetics. 6th edition: 243–247. Chichester, West Sussex, UK. Wiley-Blackwell.

4.Grifo JA, Hodes-Wertz B, Lee HL, Amperloquio E, Clarke-Williams M, et al. (2013) Single thawed euploid embryo transfer improves IVF pregnancy, miscarriage, and multiple gestation outcomes and has similar implantation rates as egg donation. J Assist Reprod Genet 30(2): 259–264.

5.Scott RT Jr, Upham KM, Forman EJ, Hong KH, Scott KL, et al. (2013) Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril 100(3): 697–703.

6.Forman EJ, Hong KH, Ferry KM, Tao X, Taylor D, et al. (2013) In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertil Steril 100(1): 100–107.

7.Yang Z, Liu J, Collins GS, Salem SA, Liu X, et al. (2012) Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet 5(1): 24.

8.Harton GL, Munné S, Surrey M, Grifo J, Kaplan B, et al. (2013) Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertil Steril 100(6): 1695–1703.

Dokumenty