Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna

Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna (PGD) jest metodą umożliwiającą badanie zarodków, u których z wysokim prawdopodobieństwem może wystąpić choroba uwarunkowana genetycznie.

preimplantacyjna
Opis ogólny

Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD)

 Metoda umożliwiającą badanie zarodków, u których z wysokim prawdopodobieństwem może wystąpić choroba uwarunkowana genetycznie. Diagnostyka tego typu ma szczególne znaczenie w przypadkach, gdy przyszli rodzice są nosicielami określonej choroby monogenowej lub translokacji zrównoważonej. Diagnostyka preimplantacyjna umożliwia wytypowanie do transferu zarodków bez defektu genetycznego, co zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania ciąży.

1. Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna w przypadku aberracji chromosomowych
2. Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna do diagnostyki chorób monogenowych

 

Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna w przypadku aberracji chromosomowych.

 

Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna jest szczególnie istotna w przypadku rodzin, w których jedno z rodziców jest nosicielem translokacji zrównoważonej. Obecność takowej może wiązać się z wyższym ryzykiem wystąpienia niezrównoważonych aberracji chromosomowych w kolejnym pokoleniu. Zastosowanie genetycznej diagnostyki preimplantacyjnej do analizy materiału genetycznego zarodków przed ich implantacją w trakcie cyklu procedury in vitro, umożliwia określenie, czy nie są one obciążone niezrównoważeniem materiału genetycznego. Dzięki tej metodzie istnieje możliwość wytypowania do transferu zarodków o prawidłowym kariotypie lub z translokacją zrównoważoną.
Z myślą o możliwości badania zarodków pod kątem obecności translokacji niezrównoważonych została opracowana metoda wykorzystująca macierze 24Sure+ Microarray. Metoda jest przystosowana do analizy materiału genetycznego uzyskanego z ciałka kierunkowego, pojedynczego blastomeru lub materiału pobranego z blastocysty pod kątem dużych niezrównoważeń chromosomowych. Jej zastosowanie może zwiększyć szansę pary na uzyskanie ciąży po cyklu zapłodnienia in vitro.
W celu zwiększenia czułości metody i możliwości wykrycia delecji/duplikacji jak najmniejszych fragmentów chromosomów, w mikromacierzach 24Sure+ Microarray zostało zwiększone pokrycie regionów okołocentromerowych (pericentromerowych) i subtelomerowych.
Główne zalety mikromacierzy 24sure+ Microarray to:

  • większa dokładność w zakresie wyboru zarodków euploidalnych lub nie posiadających niezrównoważenia materiału genetycznego niż w przypadku metod opartych o metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)
  • szybka procedura analizy umożliwiająca uzyskanie wyniku w ciągu 12 godzin
  • dedykowane oprogramowanie BlueFuse Multi Software, umożliwiające automatyczną analizę wyników, ich interpretację i wydanie wyniku
  • kompletne rozwiązanie oparte na technologii mikromacierzy do analizy dużych strukturalnych zaburzeń chromosomowych w ciałkach kierunkowych, blastomerach lub komórkach trofoektodermy

Analiza z wykorzystaniem mikromacierzy 24sure+ jest idealnym rozwiązaniem dla par decydujących się na procedurę zapłodnienia in vitro z powodu nawracających poronień, zwłaszcza w przypadkach, w których podejrzewa się obecność translokacji zrównoważonej u jednego z rodziców. Obecność takowej zazwyczaj nie powoduje wystąpienia objawów choroby u jej nosiciela, jednak w trakcie procesu gametogenezy może dojść do powstania niezrównoważonych aberracji chromosomowych w rozwijających się komórkach płciowych. Szacuje się, że u nosicieli translokacji zrównoważonych, do 50% komórek rozrodczych gamet może mieć ubytek lub nadmiar materiału genetycznego, co może prowadzić do powstania zarodków z określonym defektem chromosomowym. Efektem obecności niezrównoważenia chromosomowego jest zdecydowanie mniejsza żywotność zarodków, a tym samym większe ryzyko poronienia w przypadku uzyskania ciąży. Dlatego też pary, w których jedna z osób jest nosicielem translokacji zrównoważonej, są często diagnozowane z powodu niepłodności lub nawracających/wielokrotnych poronień, a kluczowym badaniem w ich przypadku jest analiza kariotypu. Potwierdzenie obecności translokacji zrównoważonej może być wskazaniem do badania zarodków takiej pary w kierunku obecności aberracji chromosomowych, na przykład z wykorzystaniem mikromacierzy 24sure+. Badanie preimplantacyjne w ich przypadku znacząco zwiększy szanse na posiadanie potomstwa.

 

Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna do diagnostyki chorób monogenowych

 

zzzz

                                          zzzzzzzz

Aktualnie dostępne metody wykorzystywane w diagnostyce preimplantacyjnej chorób monogenowych opierają się na badaniu dziedziczenia krótkich sekwencji tandemowych (STR) przylegających do specyficznych regionów chromosomowych (loci) związanych z określoną chorobą genetyczną. Każdy test wykorzystujący metodę analizy STR jest złożony i powinien być przygotowany i wykonywany dla określonej choroby genetycznej i indywidualnie dla pary poddającej się diagnostyce. Powoduje to, że stosowane testy są drogie, a samo badanie zajmuje dużo czasu, przez co test nie jest dostępny dla każdej pary.

Alternatywą dla metody badania sekwencji STR jest metoda kariomapowania (karyomapping), wykorzystująca całogenomową analizę dziedziczenia markerów polimorficznych. Umożliwia to dokładną analizę chromosomów i określenie, które regiony zostały odziedziczone od rodziców będących nosicielami choroby. Metoda kariomapowania wykorzystuje analizę polimorfizmu pojedynczych nukleotydów (SNP, ang. single nucleotide polymorphism) i polega na porównaniu całogenomowego profilu SNP zarodka z profilem referencyjnym – najczęściej uzyskanym z analizy SNP dla osoby chorej w rodzinie, a następnie określeniu prawdopodobieństwa wystąpienia określonej choroby genetycznej u zarodka.

W porównaniu do analizy STR, metoda kariomapowania ma wiele zalet, do których należą:

  • równomierne rozmieszczenie SNP w obrębie genomu
  • o wiele większa liczba punktów analizy (metoda wykorzystująca HumanKaryomap-12 BeadChip), co zmniejsza ryzyko niewykrycia ewentualnych rekombinacji w obrębie badanego regionu
  • metoda nie wymaga podejścia indywidualnego – zestaw nie jest dedykowany dla konkretnego pacjenta, co znacząco skraca czas wykonania badania i obniża jego koszty
  • automatyczna analiza wyników wykorzystująca oprogramowanie BlueFuse Multi

Metoda kariomapowania z wykorzystaniem zestawu HumanKaryomap-12 Bead Chip opracowana przez firmę Illumina umożliwia jednoczesną analizę około 300000 SNP, co jest wystarczające dla stworzenia „mapy” markerów związanych z określoną chorobą monogenową.

Zaletą metody kariomapowania jest możliwość analizy materiału pochodzącego z pojedynczej lub kilku komórek, co pozwala na jej wykorzystanie w diagnostyce preimplantacyjnej. Specjalnie przygotowane oprogramowanie BlueFuse Multi, z oddzielnym algorytmem do analizy danych z kariomapowania, umożliwia wizualizację i interpretację danych dla konkretnych przypadków. Należy pamiętać o tym, że analiza z wykorzystaniem zestawu HumanKaryomap-12 v1.0 BeadChip Kit nie służy do ostatecznego określenia, czy płód będzie obarczony chorobą. W teście nie są analizowane mutacje bezpośrednio odpowiedzialne za wystąpienie choroby. Służy on jedynie do określenia prawdopodobieństwa wystąpienia choroby u potomstwa.

 

Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna w przypadku aberracji chromosomowych.

TechnologiaMikromacierz 24Sure+
TechnikaMikromacierze
Maksymalna liczba próbek2 próbki/mikromacierz
Całkowity czas wykonania badania<12 godzin
System amplifikacjiSurePlex DNA Amplification System
Przygotowanie próbki do analizyFluorescent Labelling System [dCTP]
Oprogramowanie do analizyBlueFuse Multi

 

Zestaw 24sure+ Microarray umożliwia analizę materiału genetycznego z kilku lub pojedynczej komórki pod kątem obecności aberracji chromosomowych – liczbowych lub strukturalnych powodujących wystąpienie niezrównoważenia materiału genetycznego (delecji lub duplikacji suchromosomowych). W trakcie procedury, DNA kontrolny i badany, znakowane barwnikami fluorescencyjnymi, są hybrydyzowane do mikromacierzy, na której umieszczone są odpowiednio dobrane sondy oligonukleotydowe. Procedura umożliwia detekcję niezrównoważeń chromosomowych w materiale pochodzącym z pojedynczej lub kilku komórek.

Każda macierz 24sure+ Microarray zawiera 2 pola hybrydyzacyjne, zawierające takie same lub różne zestawy sond. Sondy DNA, znajdujące się na mikromacierzach 24Sure+ Microarray pochodzą z klonów BAC znajdujących się w kolekcji klonów dla genomu ludzkiego, zdeponowanej w Roswell Park. DNA z wybranych klonów BAC jest amplifikowany techniką PCR, a następnie unieruchamiany w dwóch powtórzeniach na powierzchni mikromacierzy. Klony wykorzystane do przygotowania mikromacierzy zostały wyselekcjonowane tak, aby były zlokalizowane w odległości około 600kb od siebie, dawały silny i specyficzny sygnał względem sortowanych cytometrycznie chromosomów i nie znajdowały się w miejscach polimorficznych lub regionach związanych z określoną chorobą. Po analizie danych z wykorzystaniem oprogramowania BlueFuse Multi, które usuwa niespecyficzny sygnał, efektywna rozdzielczość mikromacierzy24sure została określona na 10Mb (optymalnie do 2Mb).

Do analizy wyników zostało opracowane oprogramowanie BlueFuse Multi (v.2.4 lub późniejsze). Bazy danych, będące elementem programu, są regularnie uzupełniane o nowe typy mikromacierzy i informacje dotyczące anotacji danych, dzięki czemu wyniki analizy są wiarygodne.

Jeden zestaw 24Sure+ zawiera odczynniki wystarczające do analizy 16 próbek. W zestawie znajdują się: mikromacierze 24sure+ (8 sztuk), system do znakowania Fluorescent Labelling System (32 reakcje), DNA referencyjny męski (SureRef Reference Male DNA) i COT Human DNA.

 

Więcej informacji

Specyfikacja techniczna

Produkty do genetycznej diagnostyki preimplantacyjnej (PGD):

24sure+ Pack16 prób | PR-10-408602-PK
BlueFuse™ Multi Analysis Software

 

 

Genetyczna diagnostyka preimplantacyjna do diagnostyki chorób monogenowych

TechnologiaHumanKaryomap-12 v1.0 BeadChip Kit
TechnikaMikromacierze SNP
Maksymalna liczba próbek12 próbek/mikromacierz
Całkowity czas wykonania badaniaok. 24h
System amplifikacjiSureMDA DNA Amplification System
Przygotowanie próbki do analizyHumanKaryomap-12 (v1.0) DNA Analysis Kit
Oprogramowanie do analizyBlueFuse Multi

 

Zestaw HumanKaryomap-12 v1.0 BeadChip Kit wykorzystuje mikromacierze i technologię Infinium Karyomapping Assay, które są kompatybilne ze skanerami iScan, HiScan i systemem NextSeq 550. Uzyskane wyniki mogą być analizowane z wykorzystaniem oprogramowania BlueFuseMulti.

Technologia Infinium Karyomapping Assay wykorzystuje mikromacierze do analizy polimorfizmu pojedynczych nukleotydów (SNP). Pierwszym etapem procedury jest amplifikacja genomowego DNA wyizolowanego z pojedynczego blastomeru lub komórek pobranych z trofoektodermy zarodka za pomocą zestawu SureMDA DNA Amplification System. Uzyskana ilość DNA powinna być wystarczająca do przeprowadzenia analizy za pomocą protokołu dla macierzy Infinium. W drugim etapie procedury, razem z próbą badaną przygotowywane jest DNA rodziców i referencyjne – próbki są amplifikowane, fragmentowane i hybrydyzowane do sond znajdujących się na mikromacierzy BeadChip. Kolejnym etapem jest analiza SNP, do czego wykorzystywane są znakowane fluorescencyjnie nukleotydy. Wizualizacja i dalsza analiza danych umożliwia stworzenie profilu genetycznego badanej próbki i określenie prawdopodobieństwa wystąpienia choroby u potomstwa.

Literatura:

Handyside AH1, Harton GL, Mariani B, Thornhill AR, Affara N, Shaw MA, Griffin DK.Karyomapping: a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes. J Med Genet. 2010 Oct;47(10):651-8. doi:10.1136/jmg.2009.069971. Epub 2009 Oct 25.

Dokumenty